В эксперименте она прицельно убила злокачественные и зараженные вирусом клетки
Американские и немецкие исследователи провели эксперименты на культурах клеток и выяснили, что система CRISPR-Cas с недавно открытой нуклеазой Cas12a2 может прицельно уничтожать заданный тип эукариотических клеток (например, паразитические, злокачественные или пораженные вирусом) путем фрагментации их ДНК. Отчет о работе опубликован в журнале Nature.
Возможность селективно уничтожать заданные клетки на основании их генетической или физиологической идентичности может позволить избавляться от патологических клеток, уничтожать патогены и формировать клеточные сообщества. Это имеет множество потенциальных применений в фундаментальных исследованиях, биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве. Имеющиеся для этого инструменты, такие как низкомолекулярные ингибиторы, токсины, антитела, вирусы и модифицированные иммунные клетки, недостаточно специфичны и не могут быть нацелены на произвольные генетические или транскрипционные маркеры. Обнаруженная в бактериях система CRISPR-Cas в классическом виде позволяет прицельно редактировать геном, внося точечные разрывы в заданную последовательность ДНК, но не уничтожать клетки.
В 2023 году сотрудники Центра по исследованию инфекционных заболеваний имени Гельмгольца и Университета Юты опубликовали две статьи (раз, два), в которых описали уникальный механизм действия нуклеазы Cas12a2 системы CRISPR-Cas V типа. Распознавая заданную последовательность РНК в бактериальной клетке, она не вносит точечные правки, а запускает неизбирательную нарезку одноцепочечных РНК и ДНК и двухцепочечной ДНК на мелкие фрагменты, что останавливает у бактерий клеточный цикл и запускает SOS-ответ. Эффекты Cas12a2 в эукариотических клетках до сих пор изучены не были.
Ян Лю (Yang Liu) из Университета Юты, его коллеги и основанная для разработки этой технологии компания Akribion Therapeutics использовали в работе два родственных варианта Cas12a2: один — из бактерии Sulfuricurvum sp. PC08-66 (SuCas12a2), другой — из метагеномного образца (GeCas12a2). Они идентичны на 89 процентов и обладают схожими биохимическими свойствами. Для первого эксперимента исследователи использовали пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) с активной и инактивированной формами не критически важного гена ADE2. Система CRISPR-Cas с GeCas12a2 и нацеленной на транскрипт ADE2 гидовой РНК снизила число клеток с активной формой гена в 134 раза по сравнению с остальными клетками без признаков направляемой гомологией репарации ДНК, а SuCas12a2 — лишь вчетверо с признаками подобной репарации у 90 процентов клеток.
Схожие результаты получены в опытах на человеческих клетках разных линий, экспрессирующих трансгены и разные уровни естественных транскриптов. Анализ механизмов показал, что под действием РНК-мишени нуклеазы Cas12a2 уничтожают клетки за счет неизбирательного, масштабного и необратимого повреждения двухцепочечной ДНК, за которым следуют преимущественно апоптоз или, в меньшей степени, другие пути клеточной гибели, такие как некроз или воспаление с лизисом. Эксперименты с различными минимальными несовпадениями комплементарности не выявили признаков нетаргетной активации Cas12a2 в дрожжах и человеческих клетках по данным ДНК-баркодинга и секвенирования РНК.
Чтобы исследовать потенциальную пригодность CRISPR-Cas с Cas12a2 для лечения хронических вирусных инфекций, исследователи создали гидовую РНК, нацеленную на умеренно экспрессирующиеся транскрипты белков E6 и E7 онкогенного вируса папилломы человека (ВПЧ). Введение ее с GeCas12a2 в культуру зараженных этим вирусом человеческих клеток уменьшило их количество на 94 процента по сравнению с незараженными. Инъекция липидных наночастиц с E6-гидовой РНК и мРНК GeCas12a2 в пересаженную мыши человеческую плоскоклеточную карциному с ВПЧ 16 типа вызывало значительное замедление роста опухоли, экспрессия нуклеазы была подтверждена гистологически. В обоих случаях через 72 часа после введения GeCas12a2 в клетках-мишенях определялись маркеры апоптоза.
В следующем эксперименте авторы работы использовали CRISPR-Cas с Cas12a2 для обогащения культуры клетками с генетическими модификациями. Для этого они вносили в человеческие клетки с геном зеленого флуоресцентного белка неспецифические мутации этого гена — инделы — с помощью FnCas12a, после чего обрабатывали их GeCas12a2, нацеленной на неизмененные транскрипты того же гена. Это повысило частоту инделов в популяции клеток в 3,1 раза. После этого эксперимент повторили с точным редактированием генома — внесением точечных мутаций в ген GAPDH, кодирующий один из ферментов гликолиза, с помощью Cas9. Обработка культуры GeCas12a2, нацеленной на транскрипт неизмененного GAPDH, увеличила количество отредактированных клеток в 4,3 раза.
В заключение исследователи протестировали способность CRISPR-Cas с Cas12a2 прицельно уничтожать онкогенные клетки. Для этого они создали человеческие клетки линии U2OS с онкогенной мутацией KRASG12C и обычной формой гена KRAS и убедились, что введение в культуру Cas12a2а, нацеленной на мутантный транскрипт, уменьшает количество клеток с ним на 62 процента, не затрагивая при этом здоровые клетки. В эксперименте с человеческими клетками линии NCI-H23, изначально обладающими этой онкогенной мутацией, использование GeCas12a2 уменьшало их популяцию на 50 процентов, а в сочетании с препаратом соторасибом, также нацеленным на мутацию KRASG12C, этот показатель повышался до 85 процентов. При этом эффективность GeCas12a2 не снижалась в отношении клеток, резистентных к соторасибу.
Таким образом, система CRISPR-Cas с Cas12a2 распознает заданную последовательность РНК и измельчает их ДНК, приводя к гибели клетки, что позволяет использовать ее для прицельного уничтожения заданного типа клеток. Для применения этой системы in vivo предстоит решить еще множество задач, включая обеспечение доставки необходимого ее количества в органы-мишени, повышение эффективности, всестороннее подтверждение безопасности применения для здоровых клеток и тканей.
Ранее американские исследователи представили первый нейросетевой инструмент для создания полностью искусственных систем CRISPR-Cas9. Одну из них успешно испытали на человеческих клетках, причем наилучший ее вариант превзошел природную SpCas9 по специфичности, не уступая в эффективности.