Алгоритм использует свет химических реакций
Китайские ученые разработали метод микроскопии сверхвысокого разрешения, который обходится без лазерного возбуждения: вместо этого используется свет химических реакций. Новый алгоритм реконструкции позволил разглядеть внутриклеточные структуры с разрешением около 100 нанометров и непрерывно наблюдать за живой клеткой на протяжении 41 часа. Работа опубликована в журнале Nature.
Микроскопия сверхвысокого разрешения обычно строится на возбуждении флуоресцентных меток лазером, и это накладывает ряд ограничений. Главная проблема состоит в том, что чем ярче и дольше светит лазер, тем быстрее метки выцветают, и тем сильнее повреждается живая клетка. Альтернатива найдена в химическом свечении — у него нет фонового засвета, и оно куда бережнее к клетке. Но фотонов от единичной реакции рождается мало, поэтому для одного снимка нужна выдержка в десятки секунд, а это делает недоступным сверхвысокое разрешение, которое обычно достигается за счет анализа множества быстро сменяющихся кадров.
Цзяньдун Фэн (Jiandong Feng) из Чжэцзянского университета и Харбинского технологического института и его коллеги нашли решение проблемы. Разработанный ими метод записывает последовательность кадров свечения и ищет в мерцании отдельных молекул-излучателей корреляции между соседними пикселями. Подход чем-то похож на флуктуационную флуоресцентную микроскопию, но настроен под особенности химического, а не лазерного свечения. Чтобы компенсировать неравномерность свечения по полю зрения, авторы добавили карту энтропии, которая показывает, где на самом деле есть излучающие молекулы, и взвешивает по ней корреляционный анализ, а затем восстанавливают изображение финальной деконволюцией с ограничениями на разреженность и непрерывность сигнала.
Для электрохемилюминесцентной (ЭХЛ) микроскопии авторы сначала улучшили саму химию свечения: вместо стандартного трипропиламина они использовали в качестве сореагента бис(2-гидроксиэтил)амино-трис(гидроксиметил)метан, что подняло яркость ЭХЛ-изображений клеток примерно в 1000 раз при оптимизированных условиях визуализации. Улучшение объясняется присущим радикалу данного вещества долгим временем жизни и увеличенным расстоянием диффузии, что повышает вероятность его взаимодействия и реакции с органеллами, меченными Ru(bpy)32+. Это позволило применить новый метод к микротрубочкам клетки и получить разрешение 97 нанометров, сопоставимое с современными флуоресцентными методами сверхвысокого разрешения, причем всего по 100 кадрам с выдержкой 20 миллисекунд каждый. Метод справился и с трехмерной реконструкцией, которая была одной из главных технических проблем ЭХЛ-микроскопии. Ступенчато повышая напряжение на электроде синхронно со сдвигом фокуса, авторы различили микротрубочки, разнесенные на 235 нанометров по глубине и 116 нанометров в плоскости кадра. Новый метод с ЭХЛ подходит и для больших полей зрения: изображение площадью 0,53 × 0,53 квадратного миллиметра из девяти сшитых кадров получено со средним разрешением 153 нанометра.
Поскольку ЭХЛ-реакция запускается прямо на поверхности электрода, метод особенно чувствителен к структурам у поверхности клетки. Эту особенность использовали для сверхчувствительной визуализации белка-маркера раково-эмбрионального антигена: порог обнаружения оказался в восемь раз ниже, чем у флуоресцентного сверхразрешения за счет полного отсутствия автофлуоресцентного фона.
Тот же подход авторы перенесли на хемилюминесценцию и биолюминесценцию, используя ферментативную систему на основе люциферазы NanoLuc и флуоресцентного белка mNeonGreen с субстратом фурфуримазином. Для хемилюминесцентной съемки фиксированных клеток новый метод дал трехмерную реконструкцию митохондрий с разрешением 102 нанометра в плоскости кадра и 221 нанометр по глубине. Для биолюминесценции в живых клетках метод достиг разрешения 117 нанометров при съемке микрофиламентов, эндоплазматического ретикулума и микротрубочек, что на порядок лучше обычной биолюминесцентной микроскопии, ограниченной дифракционным пределом.
Главное преимущество биолюминесценции — это полное отсутствие лазера, а с ним — фотоповреждения и выцветания меток. В сравнении со структурированным освещением, одним из стандартных методов сверхразрешения для живых клеток, разница разительна: под непрерывным лазером уже за 18 минут теряется большая часть сигнала, а разработанный авторами метод на биолюминесценции сохраняет стабильную яркость часами. Это позволило непрерывно снимать живые клетки со сверхвысоким разрешением на протяжении 41 часа подряд без потери контраста и интенсивности свечения. Пользуясь этой выносливостью, ученые проследили за движением отдельных митохондрий при разрешении 104 нанометра: оказалось, что они движутся быстрее у края клетки и медленнее около ядра, а после примерно 25 часов съемки их количество начинает падать, а средний диаметр — расти, что похоже на признаки апоптоза. Отдельно авторы разглядели, как митохондрии передаются от одной клетки к другой, и выделили два типа движения при таком переносе: «прямое» — с почти прямолинейными траекториями и равномерной скоростью, и «непрямое» — более сложное, с остановками и последующим направленным движением к клетке-реципиенту.
Авторы подчеркивают, что разработанный ими метод не заменяет флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения, а просто компенсирует ее недостатки: сверхточные флуоресцентные методы дают субнанометровую локализацию, но плохо подходят для больших полей зрения и долгих съемок, а быстрые флуоресцентные методы для живых клеток обычно ограничены умеренным разрешением. Новый метод занимает промежуточную нишу, это сочетание приемлемого разрешения, большого поля зрения и куда большей по времени съемки живых клеток.
Ранее мы писали о том, как физики из Франции сделали акустический аналог сканирующей микроскопии, где использовали в качестве щупа пузырек воздуха.