Папа может?

Млекопитающие не умеют размножаться в одиночку — и этим отличаются от всех других позвоночных. Даже птицы, пусть в исключительных случаях, но бывает, что развиваются из неоплодотворенного яйца, а мыши — никогда. Биологи до сих пор не до конца понимают почему (об этом наш текст «Половинка себя»). 

Если у млекопитающих есть такое жесткое ограничение, какого больше ни у кого нет, логично предположить, что за ним стоит уникальный механизм. А он, если есть, наверняка влияет и на другие стороны их жизни — и хорошо бы выяснить, как именно. 

Ученые занимаются этим еще с 1980-х годов. Тогда сразу две группы независимо друг от друга предположили, что причина уникальности млекопитающих — в хитром взаимодействии родительских хромосом, без которого нормальное развитие плода невозможно. Идея подтвердилась: когда ученые вводили в яйцеклетку мыши генетический материал еще одной яйцеклетки, полноценного мышонка не получалось. С двумя ядрами сперматозоидов тоже не сработало. Тогда исследователи предположили, что существует механизм, который заставляет хромосомы «помнить», достались ли они эмбриону от матери или от отца, — и назвали его .

За сорок лет биологи много раз убеждались в существовании импринтинга у млекопитающих, но тонкости его работы исследуют до сих пор: уж слишком замысловатый механизм лежит в его основе. Верный способ понять эти тонкости — попробовать его сломать. Именно этим занимаются исследователи из Китайской академии наук, которые в январе 2025 года показали мышат, рожденных от двух отцов. Рассказываем, как они десять лет шли к этому результату и почему не остановились, когда японские коллеги обогнали их на полдороги.

Танго для двоих

К тому моменту, когда китайский биолог Ли Чжикунь и группа его коллег из Пекина взялись за дело, они уже неплохо представляли себе, как именно сперматозоид и яйцеклетка размечают свою ДНК.

За это отвечают метильные группы, которые половые клетки навешивают на ДНК во время созревания. По мере развития зародыша эти метки сохраняются, переходя по наследству во растущего тела. В результате в каждой соматической клетке взрослой мыши — как, впрочем, и человека — некоторые гены (например, Igf2 и Peg3) активны, только если расположены на хромосоме, полученной от матери, а их отцовские копии молчат. Другие (среди которых Igf2r и UBE3a) — наоборот, экспрессируются только в отцовском варианте, но не в материнском. Всего таких импринтированных генов у млекопитающих известно примерно 200 штук.

Как именно развешивание метильных меток приводит к тому, что работает только одна копия из двух, понятно не всегда. Особенно учитывая, что гены, импринтированные по отцовскому и материнскому типам, могут лежать бок о бок на одной хромосоме. Известно, что в импринтинге задействованы и белки-упаковщики ДНК, и некодирующие РНК, и регуляторные области на самой хромосоме. В случае с каждым геном нужно разбираться заново.

Зато точно известно, что бывает, если система импринтинга ломается. А ломается она регулярно — это вообще довольно непрочный механизм. Неспроста он встречается только у млекопитающих. Остальные животные так не рискуют и в большинстве своем пользуются двойными комплектами хромосом — если одна копия гена сломается, есть одна про запас. Импринтинг же этот принцип нарушает. И если с единственной рабочей копией гена что-нибудь случается, то подхватить оказывается некому. 

Так возникают болезни импринтинга, самые известные из которых — синдром Прадера — Вилли и синдром Ангельмана, оба связанные с потерей части 15-й хромосомы. Всего болезней импринтинга описано около полутора десятков, но вероятно, их гораздо больше — просто эти заболевания сложно диагностировать. И еще сложнее понять, как их можно было бы вылечить.

Зачем млекопитающие подвергают себя такой опасности? Эволюционные биологи объясняют логику импринтинга так: в момент вынашивания потомства генетические интересы отца и матери разнятся. Отцу выгодно, чтобы детеныш высосал из материнского организма побольше ресурсов, — на случай, если следующие дети у нее будут от другого самца. А матери, наоборот, выгодно не потратиться целиком на одну беременность — так выше шанс, что в течение жизни она оставит больше потомства.

Поэтому от отца зародышу достаются метки, которые заставляют работать гены, ответственные за рост плаценты. А мать, наоборот, снабжает зародыша генами, которые этот рост тормозят. В этом перетягивании ресурсов под действием отцовских генов зародыш требует больше пищи, а материнские гены этому сопротивляются.

При этом выиграть ни одна сторона не может: самих по себе материнских генов недостаточно, чтобы вырастить плод — он развивается очень слабым. И наоборот, отцовские гены, если их не сдерживают материнские, заставляют зародыш перебрать ресурсов — так, что его внутренние органы вырастают непропорционально большими. Поэтому ни детеныш от двух матерей, ни детеныш от двух отцов, как правило, не выживают.

У мышонка от родителей одного пола часть импринтированных генов экспрессируется вдвое сильнее, чем положено, а другие, наоборот, не работают совсем, потому что обе их копии молчат. И чтобы детеныш все-таки появился на свет, нужно внести множество правок в его геном. Так что живое потомство от двух матерей или от двух отцов — не просто эмбриологический курьез, но еще и знак того, что его создатели неплохо разобрались в молекулярных механизмах импринтинга.

Укрощение отца

Ли Чжикуню и его коллегам нужно было найти способ восстановить баланс: сделать так, чтобы в клетках эмбриона от родителей одного пола импринтированные гены работали только в одной копии — как и у обычных мышиных зародышей.

С мышами от двух матерей вышло относительно просто. Впервые их получили биологи из Токио еще в 2004 году, а в 2016-м Ли и его коллеги повторили этот успех. Для этого они:

1. взяли неоплодотворенную мышиную яйцеклетку и заставили ее развиваться — получился зародыш с одинарным набором хромосом, из которого извлекли гаплоидные эмбриональные стволовые клетки;
2. в этих клетках с помощью CRISPR/Cas9 удалили два участка ДНК, которые регулируют метилирование по материнскому типу в двух импринтируемых областях;
3. ввели ядро отредактированной гаплоидной стволовой клетки в неоплодотворенную мышиную яйцеклетку.

В результате на свет появились мышата, практически не отличимые от обычных. Поначалу они весили меньше нормы, но потом догнали сверстников и выросли в полноценных плодовитых мышей. Возможно, не все гены у них работали в нужном числе копий, и тем не менее двух правок оказалось достаточно, чтобы избавить их от генетического перекоса.

Было понятно, что с отцами так легко не получится. Дело в том, что генов, импринтированных по материнскому и отцовскому типу, в геноме примерно поровну. А вот участков, на которые навешиваются метильные метки — и которые, собственно, обеспечивают импринтинг этих генов, — в яйцеклетках в четыре раза больше, чем в сперматозоидах. Причем они разбросаны мелкими локусами по . Поэтому, чтобы обойтись без яйцеклетки, нужно не только заставить замолчать несколько участков отцовской ДНК, но и дать голос множеству тех, которые действуют в интересах матери. Решить эту проблему одним взмахом генетических ножниц не получится.

Первая попытка Ли и его коллег в 2018 году закончилась предсказуемой неудачей. Ученые один за другим выключили семь ключевых участков в , но все, чего им удалось добиться, — двенадцать мышат, которые дожили до появления на свет, и лишь двое, которые пережили первые два дня.

Принципиально другое решение проблемы в 2023 году предложили японские ученые. Вместо того чтобы резать гены по одиночке, они перекроили геном самца мыши целиком — и превратили его в женский. Для этого им пришлось:

1. размножить мышиные стволовые клетки в культуре,
2. отобрать те, что случайно потеряли Y-хромосому,
3. потом заставить их удвоить оставшуюся Х-хромосому — получились стволовые клетки с генотипом ХХ.
4. Из получившихся клеток вырастить яйцеклетки 
5. и оплодотворить их сперматозоидом обычной мыши.

План сработал: мышата родились живые, здоровые и фертильные.

Японские ученые таким образом, казалось бы, перегнали китайских. Но Ли и его команда не собирались останавливаться — потому что они решали совсем другую задачу. Японский эксперимент позволил получить мышонка от двух отцов — но не позволил ничего нового узнать про импринтинг. Исследователи предоставили природе все сделать самой: они вырастили полноценную яйцеклетку, которая навесила метильные метки на все необходимые участки генома.

То есть вместо того, чтобы перепрыгнуть этот барьер, японцы просто оббежали его сбоку. Китайцы же планировали взять его по-настоящему — и заодно посмотреть, из чего он состоит.

Через барьер

Ли и его коллеги были неприятно удивлены тем, что даже семь правок в геном не помогли получить мышей от двух отцов. И задумались: а точно ли им мешает только импринтинг? Если существует еще какой-то барьер, который не дает млекопитающим размножаться без участия самки, то мышата от двух отцов — не лучшая модель, чтобы разбираться в импринтинге. Тогда исследователи решили попробовать добавить правок.

Для начала они еще раз внимательно осмотрели мышат с семью правками. Даже те из них, кто пережил появление на свет, выглядели нездоровыми: они весили больше нормы, у них разрослись внутренние органы, язык не помещался в рот, а глаза не закрывались. Это согласуется с теорией о перетягивании ресурсов: похоже на то, что лишняя копия отцовских генов и нехватка материнских действительно приводят к тому, что плод слишком активно высасывает питательные вещества.

Ученые выделили среди импринтированных генов еще несколько связанных с ростом плода — и с помощью системы CRISPR/Cas начали отключать их по очереди. Сначала они вырезали три области, регулирующих метилирование (при этом сами гены остались на месте, но перестали работать «в интересах отца»). Затем еще пять участков с генами. А потом — кодирующие части четырех генов (среди них один входил в первую семерку выключенных генов, но на этот раз у него отрезали часть побольше). И с каждой попыткой — без 10, без 15 и без 18 импринтированных генов — до появления на свет доживало все больше и больше мышат.

Мышата без 18 генов уже были похожи на своих обычных сверстников: их внешние и внутренние органы стали нормального размера. Но большинство детенышей не смогли нормально сосать, даже несмотря на то, что дышали самостоятельно. В итоге до взрослого возраста дожил всего один из них.

Тогда ученые обратили внимание на еще один импринтированный ген, NNAT, — он у человека связан с аномалиями строения лица. Они предположили, что и у мышей он может влиять на развитие лицевого отдела черепа и тем самым — на способность сосать. Поэтому они внесли еще одну, уже девятнадцатую, правку в мышиный геном и удалили регуляторную область, которая управляет метилированием NNAT. В итоге животные справились с сосанием, и больше трети из них (22 из 60) дожили до взрослого возраста.

Мыши с 19 правками отличались от обычных животных: исследователи заметили, что они охотнее выходят в центр открытой камеры (это указывает на подавленное тревожное поведение) и у них меньше гиппокамп. И прожили они почти вдвое меньше контрольных мышей.

Кроме того, у них была еще одна важная особенность: как и у всех их предшественников из экспериментов Ли, у этих зародышей не получалось самостоятельно вырастить плаценту. Чтобы это обойти, во всех своих попытках ученые пользовались тетраплоидными эмбрионами мыши. То есть: брали оплодотворенную мышиную яйцеклетку, ждали первого деления, а потом сливали друг с другом первые две клетки. Получался зародыш с четырьмя наборами хромосом, который может просуществовать несколько дней и образовать предшественники зародышевых оболочек и плаценты, а вот плод из него не развивается. Именно в такой зародыш исследователи вводили отредактированные мышиные клетки, чтобы они внутри него могли вырасти в мышат.

Чтобы избавиться от схемы с вспомогательным зародышем, биологи обратили внимание на еще один импринтированный участок генома. Он связан с развитием плаценты и, к тому же, у мышей от двух отцов с девятнадцатью правками экспрессировался не так, как у обычных животных. Исследователи заподозрили, что этот участок кодирует один ген (экспрессию которого они уже исправили на предыдущих этапах) и 72 микроРНК. Они удалили его целиком. Мышата с двадцатью правками оказались уже полностью самостоятельными — и сами отрастили себе плаценту.

Итого: 20 правок.

Мышь как предлог

Вырастив жизнеспособного мышонка, ученые уверились в том, что дело действительно в импринтинге. Просто барьер, который мешает получить потомство от двух отцов, оказался значительно выше, чем тот, который стоит на пути к мышатам от двух матерей: двадцать правок против двух.

Процедура не выглядит легко воспроизводимой: эффективность у нее низкая, в лучшем случае 6 процентов. И получившиеся мыши все равно не способны размножаться — по-видимому, двадцать правок в геноме не проходят даром и мешают развиваться сперматозоидам. В этом смысле методика японцев, которые просто превратили мужскую клетку в женскую, кажется куда более удобной.

Вот только мышонок от двух родителей не был самоцелью эксперимента — ни японского, ни китайского. Японские исследователи выясняли, что нужно для выращивания яйцеклетки, — и отрабатывали на мышатах методики хромосомной инженерии. Мышонок от двух матерей стал живым доказательством того, что их яйцеклетка вышла полноценной, а геномный импринтинг их сам по себе не интересовал. 

Китайские же ученые занимались инженерией на уровне отдельных генов, и им важно было получить мышонка без участия хромосом яйцеклетки. Так что они перепрыгнули генетическое препятствие по-настоящему — а заодно измерили его высоту: чтобы компенсировать отсутствие матери на генетическом уровне, нужно двадцать правок и никак не меньше.

С этим барьером теперь можно работать дальше. Выяснять, в каких именно процессах задействованы эти двадцать участков. Изучать, как они взаимодействуют. Искать аналоги у людей и смотреть, с какими болезнями они связаны, — возможно, получится их исправить, подобно тому, как коррекция одного гена научила мышей от двух отцов самостоятельному сосанию.

Так что смысл новой китайской работы — не в эффективности. Их результат, возможно, не так впечатляет, как у японских коллег, зато с фундаментальной точки зрения не менее ценен. Иногда это тоже нужно — пойти прямо в гору, а не обойти ее. Иначе можно никогда не узнать, что там, наверху.