Лимфоциты превратили в терапевтические CAR-T-клетки сразу в организме

Американские исследователи разработали метод продукции Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами непосредственно в организме для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний. Технологию успешно испытали на мышах и макаках. Отчет о работе опубликован в журнале Science.

Технология Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами (подробно о них рассказано в материале «Химера против рака») — наиболее эффективный и перспективный метод лечения В-клеточных гематологических новообразований и некоторых других злокачественных опухолей. В клинических испытаниях он также демонстрирует высокую эффективность при различных аутоиммунных заболеваниях, что значительно расширяет потенциальную сферу его применения. Серьезное препятствие на пути массового внедрения CAR-T-терапии представляет сложность ее проведения и, как следствие, высокая стоимость. Имеющиеся методы предполагают преимущественно получение аутологичных CAR-T-клеток, для чего необходимо выделить Т-лимфоциты из крови пациента, ввести в них трансген CAR-конструкта на вирусном векторе, размножить клетки в питательной среде и инфузонно ввести их обратно пациенту (как правило, после лимфодеплеции). Такой цикл лечения требует специализированных клиник, может занимать до полугода и стоит десятки и сотни тысяч долларов.

С целью упростить применение CAR-T-терапии Айк Агаджанян (Haig Aghajanian) из Пенсильванского университета и компании Capstan Therapeutics с коллегами занялся разработкой метода продукции CAR-T-лимфоцитов in vivo. Для прицельной доставки мРНК CAR-конструкта в заданные иммунные клетки исследователи создали таргетные липидные наночастицы (тЛНЧ), основываясь на технологии, которая применяется для доставки мРНК-вакцин. Для этого методом рационального дизайна они создали ионизируемый катионный липид L829, инкапсулировали в него мРНК (для начальных экспериментов она кодировала флуоресцентный белок люциферазу) и встроили в эти тЛНЧ антитела к Т-лимфоцитарному антигену CD5. Их сравнили с тЛНЧ из липидов противоковидной вакцины ALC-0315 (BNT162b2) в экспериментах на животных. Разработанные CD5-L829-tLNP обеспечивали усиленную экспрессию трансгена в Т-клетках и низкую нецелевую — в печени мышей, при этом L829 в отличие от ALC-0315 быстро выводился из печени и не накапливался в ней. В опытах на крысах и макаках-крабоедах наблюдалась хорошая переносимость CD5-L829-tLNP в дозах соответственно 5 и 3 миллиграмма на килограмм массы тела.

Поскольку для терапии предпочтительно оснащать химерным рецептором цитотоксические CD8⁺ T-лимфоциты, следующее поколение тЛНЧ снабдили антителами для прицельного связывания с этим антигеном. Эти наночастицы (CD8-L829-tLNP) использовали для доставки анти-CD19-CAR-конструкта (он предназначен для прицельной атаки на В-лимфоциты и применяется в терапии В-клеточных новообразований и аутоиммунных заболеваний). В эксперименте на мышах такой препарат обеспечивал быструю и прицельную продукцию CD8⁺ CAR-T-лимфоцитов в крови, селезенке, костном мозге и лимфоузлах, которая носила временный характер со снижением экспрессии в течение 72 часов. Такие CAR-T-клетки демонстрировали антиген-специфичную цитотоксичность, пролиферацию и продукцию цитокинов. Дальнейшие эксперименты по модификации нетранслируемых участков и частот использования кодонов мРНК анти-CD19-CAR-конструкта позволили дополнительно усилить его экспрессию в Т-лимфоцитах и повысить их избирательную цитотоксичность.

На следующем этапе экспериментов авторы работы использовали мононуклеарные клетки периферической крови пациентов с разными аутоиммунными заболеваниями и схожих с ними по возрасту здоровых людей. CD8-L829-tLNP обеспечивали продукцию из них анти-CD19-CAR-T-лимфоцитов с сопоставимым выходом, причем CAR-T-клетки из крови пациентов эффективно лизировали аутологичные В-лимфоциты. Затем человеческие периферические мононуклеары переливали иммунодефицитным мышам и после их приживления вводили внутривенно 10 или 30 микрограмм человеческих CD8-L829-tLNP-CD19. Это обеспечило прицельную экспрессию трансгена в цитотоксических Т-клетках (но не CD4⁺ клетках памяти) и практически полную деплецию В-лимфоцитов в течение 24 часов. В аналогичном опыте с дополнительной имплантацией мышам ксенографта человеческих злокачественных В-лимфобластов Nalm6 две 30-микрограммовые дозы CD8-L829-tLNP-CD19, введенные в течение недели, обеспечили практически полное исчезновение опухоли у всех пяти животных.

После этого исследователи перешли к испытаниям на макаках-крабоедах (Macaca fascicularis), используя CAR к В-лимфоцитарному антигену CD20 (поскольку человеческий CD19 не кросс-реактивен у этих обезьян). В трех экспериментах 22 животных получили инъекции от 0,1 до 2,0 миллиграмма CD8-L829-tLNP-CD20 на килограмм массы тела каждые 72 часа до трех раз. Премедикацию антигистаминами или глюкокортикоидами не проводили. Переносимость в целом была хорошей, однако одну обезьяну после третьей дозы 1,5 миллиграмма на килограмм нашли лежащей малоподвижно с гипотермией. Анализы выявили у нее известный побочный эффект CAR-T-терапии — связанный с эффекторными клетками синдром, схожий с гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом; животное подвергли эвтаназии. У остальных обезьян наблюдались легкие и транзиторные повышения уровней цитокинов и печеночных ферментов.

Уровень В-лимфоцитов в крови резко снижался через шесть часов после первой дозы и был неопределяемым через сутки. В зависимости от дозы после третьего введения препарата CAR экспрессировали до 85 процентов CD8⁺ T-клеток и до 95 процентов CD8⁺ NK-клеток с минимальным вовлечением CD4⁺ T-клеток. После дозы 1,5 миллиграмма на килограмм восстановление популяции В-лимфоцитов начиналось около 21 дня и приближалось к исходному уровню к 35 дню. При этом В-клетки памяти были в основном уничтожены, и в кровоток поступали преимущественно наивные клетки. Это свидетельствует о перезагрузке иммунной системы аналогично той, что наблюдается при CAR-T-терапии ex vivo. Дополнительные эксперименты еще на 15 макаках-крабоедах показали, что две дозы CD8-L829-tLNP-CD20 с интервалом 72 часа по эффективности практически не уступают трем и обладают лучшим профилем переносимости и безопасности. Также было показано, что премедикация антигистаминами и глюкокортикоидами не влияет на продукцию CAR-T-лимфоцитов in vivo и деплецию В-клеток.

Полученные результаты показали, что разработанная платформа L829-tLNP имеет потенциал исключить потребность в сложной продукции CAR-T-лимфоцитовex vivo и сделать CAR-T-терапию более доступной для проведения по различным показаниям. Однако для ее дальнейшей разработки необходимы дальнейшие многостадийные доклинические и клинические испытания.

Поиском способов (в основном менее радикальных) усовершенствовать CAR-T-терапию и повысить ее эффективность занимались и занимаются различные научные группы. К примеру, с этой целью предлагали снижать истощаемость CAR-T-клеток выключением регуляторного белка Cbl-b, давать им отдых, обучать производству интерлейкина-2, выключать TCR при помощи CRISPR/Cas9, задействовать неканонический путь NF-кB, использовать природную мутацию Т-клеточных опухолей и добавлять в культуру трансгенных клеток ингибитор Bcl-2.