Фертильных мышей обоих полов получили с использованием только мужского генома

Японским исследователям удалось изменить пол мышиных эмбрионов с мужского на женский путем элиминации Y-хромосомы на ранних стадиях развития с помощью CRISPR-Cas9. Совместив эту методику с оптимизированным переносом ядер соматических клеток, они получили фертильное потомство обоих полов, используя только геном самцов. Препринт статьи доступен на ресурсе bioRxiv.

Пол млекопитающих определяется парами половых хромосом, XX соответствует женскому полу, XY — мужскому. Изначально все эмбрионы развиваются по женскому пути, однако в определенный момент ген SRY, находящийся в Y-хромосоме, блокирует развитие женских половых органов и запускает развитие мужских. В отсутствие этого гена у мышиных эмбрионов с кариотипом XY они развиваются как самки с формированием яичников, но эти органы зачастую несут различные структурные и функциональные аномалии, что приводит к бесплодию. В то же время самки мышей с одной X-хромосомой (кариотип X0) здоровы и фертильны. Аналогичные явления наблюдаются и у многих других животных. Таким образом, элиминация Y-хромосомы на ранних стадиях развития эмбриона может приводить к появлению фертильных женских особей из мужского генома при использовании технологии переноса ядер соматических клеток. Это может представлять большой интерес при восстановлении популяций исчезающих видов, в которых самок недостаточно для обеспечения генетического разнообразия.

Такаси Исиути (Takashi Ishiuchi) из Университета Яманаси и его коллеги оттолкнулись от того факта, что инактивация центромеры Y-хромосомы в оплодотворенной яйцеклетке препятствует ее передаче следующим поколениям клеток при делении. Они воспользовались системой редактирования генома CRISPR-Cas9, создав три независимые гидовые РНК (гРНК), нацеленные на центромеру Y-хромосомы, и выбрав наиболее эффективную из них (Y3). CRISPR-Cas9 с этой гРНК стабильно элиминировала Y-хромосому в культурах клеток, авторы работы назвали этот подход Y-CUT. При его применении к мышиным зиготам появлялось потомство, состоящее только из самок. Около половины из них (43 процента) предсказуемо обладали кариотипом X0.

В ходе опытов выяснилось, что инбредные лабораторные мыши с Y-хромосомой от подвида Mus musculus domesticus более чувствительны к Y-CUT, чем от подвида Mus musculus musculus, и дальнейшие эксперименты проводили с такими линиями животных. Чтобы проследить судьбу Y-хромосомы после применения Y-CUT к зиготе, исследователи воспользовались флуоресцентной гибридизацией ДНК in situ (DNA-FISH). Оказалось, что, начиная со стадии двух клеток, она секвестрируется в одно или два микроядра, и к стадии морулы находится практически только в них. В дальнейшем эти микроядра, вероятно, деградируют путем аутофагии, поскольку на более поздних стадиях не определяются.

При обычном использовании переноса ядер соматических клеток пол клонов совпадает с полом донора ядра. С целью получить потомство обоих полов только из ядер донора-самца авторы работы использовали оптимизированный протокол переноса с применением ингибиторов HDAC и G9a для повышения эффективности. После переноса ядер клеток Сертоли новорожденного самца мыши к эмбрионам путем электропорации применили Y-CUT. Таким образом были получены 13 эмбрионов (уровень рождаемости среди перенесенных эмбрионов 11 процентов), 10 из которых оказались самками с кариотипом X0. Все животные обоих полов выросли до взрослого состояния и при скрещивании дали потомство. У самок этого потомства был нормальный кариотип XX, то есть половое размножение восстанавливало нормальный хромосомный набор.

Эту процедуру успешно повторили, используя в качестве доноров ядер клетки крови или фибробласты взрослого самца мыши, а затем и криоконсервированные клетки крови самца. Во всех случаях получалось здоровое фертильное потомство обоих полов — мужского без применения Y-CUT и преимущественно или только женского после его использования. Анализ кариотипов клеток клонов методом FISH показал, что Y-CUT селективно элиминирует Y-хромосому без дополнительных транслокаций и признаков мозаицизма. Полногеномное секвенирование подтвердило нормальное число аутосом и X-хромосому при полном отсутствии Y-хромосомы у клонированных самок с кариотипом X0. Нетаргетные события зарегистрированы менее чем в одном проценте проверенных локусов и представляли собой мозаичные мутации из инделов длиной 1–10 пар оснований вне экзонных областей.

В завершение исследователи проверили возможность генетического кодирования Y-CUT для создания программируемой платформы для элиминации Y-хромосомы in vivo. Для этого они создали генно-модифицированных мышей с использованием нацеленной на ROSA26 кассеты, экспрессирующей гРНК Y3 и Cre-зависимую эндонуклеазу Cas9. При транзиторной экспрессии рекомбиназы Cre в эмбриональных стволовых клетках таких животных происходила элиминация Y-хромосомы. После этого аналогичный подход повторили индуцируемой тамоксифеном рекомбиназой MerCreMer и получили такой же эффект при обработке эмбриональных стволовых клеток 4-гидрокситамоксифеном. В эксперименте in vivo трансгенных мышей, экспрессирующих Cre-зависимую CRISPR-Cas9, скрестили с Sox2-Cre/+ мышами, которые экспрессируют Cre во всех эмбриональных линиях. В таком потомстве преобладали самки (64 процента), и половина Sox2-Cre-положительных самок имела кариотип X0.

Таким образом, комбинация элиминации Y-хромосомы с помощью CRISPR-Cas9 и переноса ядер соматических клеток позволяет получить фертильное потомство обоих полов со стабильным геномом, используя только ядра самцов, в том числе из криоконсервированных клеток. Генетически запрограммированная элиминация Y-хромосомы может служить программируемой платформой для преобразования пола эмбриона с мужского на женский с получением фертильных самок.

Ранее разным научным группам удавалось вырастить из стволовых клеток функциональные сперматозоиды мышей (об этом материал «Внуки стволовой клетки») и крыс и использовать их для зачатия жизнеспособного и фертильного потомства, а также получить функционирующие яйцеклетки из клеток человеческой кожи (хотя эмбрионы при их оплодотворении получались анеуплоидными).